SINTESI DEL PROGETTO
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Open Data PON REC
L'obiettivo di questo progetto è quello di realizzare un laboratorio in cui convergano molteplici conoscenze e tecnologie per lo sviluppo di nuovi preparati anti-infettivi ad azione anti-epatite C. In particolare verranno sviluppati:1.Anticorpi ad attività neutralizzante anti-epatite C provenienti da pool di plasma considerevolmente ampi di pazienti con infezione in fase acuta o cronica.2.Preparazione e caratterizzazione funzionale di miscele di scFV ad attività neutralizzante per il virus dell'epatite C.3.Realizzazione di modelli animali per lo studio e la valutazione delle proprietà funzionali delle immunoglobuline e dei scFV e per lo studio dei meccanismi patogenetici dell'infezione.Il progetto di ricerca si articolerà in più fasi successive, determinate dai sei Obiettivi Realizzativi (OR) e dalle relative attività.In una fase iniziale del progetto i gruppi di ricerca provvederanno alla raccolta di un ampio pool di plasma di pazienti con epatite C cronica o acuta, alla messa a punto di un metodo di purificazione rapido efficace e sicuro (dal punto di vista dell'infettività virale) di un concentrato di immunoglobuline anti-epatite C in scala di laboratorio ed infine alla valutazione della trasferibilità del metodo di purificazione su scala più ampia. Tali immunoglobuline rappresentano un primo preparato a potenziale attività antivirale. In parallelo, si procederà alla determinazione delle sequenze delle varianti virali più abbondanti presenti nel pool di plasma iperimmune ed alla definizione di sequenze consenso relative agli antigeni del capside del virus. Tali sequenze saranno generate per sintesi chimica sotto forma di frammenti di circa 20 aminoacidi in modo da coprire le intere sequenze delle due proteine di superficie, E1 ed E2. Tutti i peptidi generati, opportunamente caratterizzati, saranno impiegati per la costruzione di biochips. In una fase successiva, le proteine più abbondanti sono prodotte in laboratorio in vari sistemi cellulari, purificate, caratterizzate ed utilizzate come immunogeni per la produzione di anticorpi monoclonali e successivamente di domini scFv. Le proteine ricombinanti sono inoltre impiegate per produrre digeriti enzimatici che, previa caratterizzazione, sono utilizzati per la costruzione di altri biochips. Tutti i biochips così costruiti sono quindi impiegati per la l'identificazione degli epitopi riconosciuti dalle immunoglobuline iperimmuni e gli epitopi più rappresentativi sono successivamente ri-preparati per sintesi chimica ed utilizzati per la preparazione di nuovi anticorpi monoclonali e relativi scFv. Dagli scFv si otterranno quindi delle miscele note di tali reagenti che costituiranno un secondo potenziale preparato anti-virale. In una terza fase del progetto, in parte parallela alle attività descritte, saranno realizzati dei modelli per l'infezione del virus; in particolare saranno realizzati dei topi transgenici esprimenti recettori e/o co-recettori umani noti dell'HCV e su tali modelli sarà valutata innanzitutto l'infettabilità degli animali e quindi la validazione del modello animale ottenuto, successivamente saranno valutati gli effetti protettivi dei preparati di immunoglobuline policlonali anti-epatite C, e dei scFv anti-epitopi selezionati. In parallelo, si valuterà la tossicità e l'efficacia in vitro dei preparati su linee cellulari selezionate e in topi esprimenti antigeni virali.
